1 材料与方法
1.1 实验动物及细胞系
spf 级 sd 大鼠 30 只，体质 量（220±20 g），雌雄各半，由安徽医科大学实验动物 中心提供，许可证号：scxk（皖）2017-001，本研究 所涉及的动物实验部分均符合动物伦理委员会的准 则。16hbe 细胞株购自上海子实生物科技有限公司。
1.2 药物及试剂
化痰降气胶囊由白芥子、紫苏子、 白前、金沸草、当归、炙麻黄六味中药组成，每克 含 0.833 g 生药，临床成人每日服用量为 6 g，相当 于生药量的 5 g，安徽中医药大学附属医院制剂 中心提供，批号：；高糖培养基（dmem）， 美国 hyclone 公司，批号：ad；胎牛血 清，美国 gibco 公司，批号：42g5760k；5-羧基二 乙 酸 荧 光素（5- cfda），美国 sigma 公司，批号：bcbt5849；胰 酶 消 化 液 、 bca 蛋 白 定 量 试 剂 盒 、 ltd4 受体拮抗剂（mk571）、cck8 试剂盒，碧云天 生 物 技 术 研 究 所 ， 批 号 分 别 为 ： 、 、 、 ； 光 谱彩虹预染蛋白 marker，美国 fermentas 公司，批 号：；mrp1 抗体、notch1 抗体、hes1 抗 体 ， 英 国 abcam 公 司 ， 批 号 分 别 为 ： ab180960、 ab52627、ab108937；甘油醛-3 磷酸脱氢酶（gapdh） 抗体、辣根酶标记山羊抗兔 lgg、辣根酶标记山羊抗 小鼠 lgg，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分 别为：oti2d9，zb-2301，zb-2305；ecl 超敏发光 试 剂 盒 ， 美 国 thermo 公 司 ， 批 号 ： si257444； dapt，美国 ape x bio 公司，批号：208255-80-5。
1.3 仪器
371 型 co2细胞培养箱、1500 型全波长酶 标仪，美国 thermo scientific 公司；超净工作台（yj1405），苏净集团安泰公司；倒置相差显微镜、荧光 显微镜，日本 olympus 公司；流式细胞仪，美国 beckman 公司；蛋白电泳及转膜设备，北京六一生物 科技有限公司；凝胶成像仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.4 含药血清的制备
sd 大鼠 30 只，适应性饲养 1 周后随机分为空白组和给药组。将化痰降气胶囊中 的粉末用生理盐水配成 0.07 g·ml-1 的混悬液，给药 组按照 10 ml·kg- 1 灌胃给药，每天 2 次，连续 7 d。 空白组给予等剂量的生理盐水。末次给药 1 h 后，腹 腔注射 20%乌来糖麻醉（1 g·kg-1 ），腹主动脉取血， 37 ℃静置 1 h 后，3 500 r·min-1 ，离心 10 min；将 相同条件下所采血清混和，56 ℃水浴灭活 30 min，以 除去可能存在的生物活性物质；再用 0.22 μm 的微 孔滤膜过滤除菌，密封后置于-80 ℃冰箱保存备用。 同时以生理盐水制备的正常大鼠血清作对照。
1.5 香烟烟雾提取物（cse）的制备及实验室前期预实验
将一根去过滤嘴香烟点燃，烟雾 通过注射器连续抽吸与 5 ml 的 dmem 剧烈摇晃混 合，调整 ph 值至 7.2~7.4，经 0.22 μm 微孔滤膜过 滤除菌，此时 cse 浓度定为 99%，根据前期预实验 结果，采用 5% cse 浓度用于后续实验。
1.6 细胞培养、分组及给药方法
将 16hbe 细胞培 养于 dmem 培养基（含 10%胎牛血清，100 u · ml-1 *和*）中，置于 37 ℃、5% co2 培养箱中 培养，每 2 d 换液 1 次，4～5 d 细胞生长密度达到 80%左右以 0.25%*消化、传代。将细胞分为 空白血清组（15%正常大鼠血清）、化痰降气胶囊含药血清低、中、高剂量组（5%、10%、15%含药血清）、 cse 刺激组（5% cse+15%正常大鼠血清）、cse+含 药血清组（5% cse+15%含药血清）、dapt 抑制剂组 （50 μmol · l-1 dapt+15%空白血清）、dapt 抑制剂 加中药组（50 μmol · l-1 dapt +15%含药血清）。
2 结果
2.1 化痰降气胶囊含药血清对 16hbe 细胞活力的影响
与正常对照组比较，5% ~ 20%浓度的化痰降气 胶囊含药血清促进细胞增殖，差异有统计学意义 （p < 0.01）。且浓度为 15%时，16hbe 细胞增殖率。故选用 5%、10%、15%为低、中、高浓度用于 后续研究。
2.2 各组 16hbe 细胞中 notch1、hes1、mrp1 蛋白表达
比较 利用 western blot 技术，以 gapdh 为内 参，计算各组细胞中 notch1、hes1、mrp1 蛋白的相 对表达量。与空白血清组比较，各含 药血清组 notch1、mrp1、hes1 蛋白表达均呈浓度依 赖性升高；其中 5%浓度组 hes1 蛋白表达及 10%、 15%浓度组 notch1、mrp1、hes1 蛋白表达均有统计 学意义（p < 0.05，p < 0.01）。15%化痰降气胶囊含 药血清上调 notch1、mrp1、hes1 蛋白表达的趋势显著，故在后续实验中均选用此浓度的含药血 清。与空白血清组比较，cse 刺激组 的 notch1、mrp1 、hes1 蛋白表达显著降低（p < 0.01）；与 cse 刺激组比较，化痰降气胶囊含药血清 干预可逆转 cse 诱导的蛋白表达下调，差异有统计 学意义（p < 0.05，p < 0.01）。与空白 血清组比较，dapt 抑制剂组 notch1、mrp1、hes1 蛋白表达含量均显著下降（p < 0.05，p < 0.01），15% 含药血清可显著提高 notch1、mrp1、hes1 蛋白的表 达（p < 0.05，p < 0.01）。与单独加入 15%含药血清 组比较，dapt + 15%含药血清组的 notch1、hes1、 mrp1 蛋白表达含量均下调，差异有统计学意义 （p < 0.05，p < 0.01），说明抑制 notch 通路，有抑制 含药血清上调 mrp1 表达的作用。
3 讨论
慢性阻塞肺病（copd）是一种可防治的常见疾 病，其特征为持续存在的呼吸道症状和气流受限， 通常由有害颗粒或气体暴露引起的气道和（或）肺泡 异常而导致。目前，copd 的发病机制尚未*明 了，主要与肺内氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失 衡、肺部炎性反应及免疫功能紊乱密切相关，往往 是机体内外多种因素相互作用的结果 。mrp1 作 为两性有机阴离子转运载体，在肺组织中发挥重要 的屏障功能，其对吸入性化学异物或毒物、其特异性底物白三烯 c4（ltc4）、及在肺部氧化应激的病理生 理过程中起重要作用的还原型*（gsh）、氧化 型*（gssg）都起着外排功能 ，还可以调控 反炎症信号以控制嗜中性粒细胞的跨上皮迁移从而 减少过度炎症。
免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在时间进行处理。